Optimasi Metode Nested PCR untuk Deteksi Vibrio parahaemolyticus AHPND pada Udang Vaname (Litopenaeus vannamei)

Optimization of Nested PCR Method for Vibrio parahaemolyticus AHPND Detection in Vannamei Shrimp (Litopenaeus vannamei)

Indonesia memiliki permintaan pasar yang tinggi pada komoditas udang vaname. Budidaya udang vaname memiliki risiko tinggi terjangkit penyakit, salah satunya Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) yang disebabkan oleh Vibrio parahaemolyticus strain AHPND. Penyakit ini sangat menular dan memiliki angka kematian hingga 100%. Deteksi dini diperlukan untuk memprediksi penyebaran dan mengurangi risiko kegagalan produksi. Deteksi dapat dilakukan menggunakan metode AP4 nested PCR, namun masih banyak hasil PCR yang kurang optimal sehingga perlu dilakukan optimasi metode. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui konsentrasi primer dan suhu annealing yang optimal untuk deteksi V. parahaemolyticus strain AHPND pada udang vaname pada metode AP4 nested PCR. Tahapan penelitian meliputi ekstraksi DNA, amplifikasi, dan elektroforesis. Pada amplifikasi dilakukan optimasi konsentrasi primer (2,5 μM, 5 μM  dan 10 μM ) dan suhu annealing (53°C, 58°C dan 63°C). Hasil amplifikasi pada setiap perlakuan memperoleh pita dengan ukuran 230 bp, tidak terdapat smear, primer dimer dan mispriming, namun memiliki variasi ketebalan yang berbeda. Pada suhu annealing 58°C dan konsentrasi primer 5 μM diperoleh hasil terbaik berupa pita yang paling tebal dan tunggal dibandingkan pada perlakuan yang lain. Berdasarkan hasil tersebut, dapat disimpulkan bahwa metode AP4 nested PCR terbaik adalah menggunakan suhu annealing 58°C dan konsentrasi primer 5 μM. Hasil penelitian ini memberikan wawasan baru terkait suhu annealing dan konsentrasi primer yang optimal untuk deteksi V. parahaemolyticus strain AHPND pada udang vaname dengan metode AP4 nested PCR. 

Indonesia has a high market demand for vannamei shrimp commodities. Vannamei shrimp culture has a high risk of contracting diseases, one of which is Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (AHPND) caused by Vibrio parahaemolyticus strain AHPND. This disease is highly contagious and has a mortality rate of up to 100%. Early detection is needed to predict deployment and reduce the risk of production failure. Detection can be carried out using the AP4 nested PCR method, but many PCR results are not optimal, so it is necessary to optimize the method. The purpose of this study was to determine the optimal primer concentration and annealing temperature of AP4 nested PCR method. The steps of the research included DNA extraction, amplification, and electrophoresis. In the amplification, optimization of primer concentration (2.5 μM, 5 μM, and 10 μM ) and annealing temperature (53°C, 58°C, and 63°C) was carried out. The amplification results for each treatment obtained a band of 230 bp, no smears, primer dimers and mispriming, but had different thickness variations. At annealing temperature of 58°C and primer concentration of 5 μM, the best results were obtained in the form of the thickest and single band compared to the other treatments. In conclusion based on these results that the best optimization method is using an annealing temperature of 58°C and 5 μM of primer concentration. This study provided new knowledge regarding the optimal annealing temperature and primer concentration for detection of V. parahaemolyticus strain AHPND in vannamei shrimp by AP4 nested PCR method.